本文是学习GB-T 33127-2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了甘蔗线条病毒的检疫鉴定方法。
本标准适用于可能带有甘蔗线条病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
中文名：甘蔗线条病毒。
学名：Sugarcane streak virus。
缩写：SSV。
分类地位：双生病毒科(Geminiviridae),玉米线条病毒属(Mastrevirus)。
甘蔗线条病毒的其他信息参见附录 A。
SSV 的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。利用常规 PCR、
实时荧光PCR、 双抗体
夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 和免疫电镜方法对样品进行检测。
电子天平(感量0.001
g)、高速离心机、小型瞬时离心机、超低温冰箱(一80℃)、制冰机、涡旋振荡
器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH 计、透射电子显微镜、超净工作台、PCR
仪、实时荧光定量 PCR 仪、微
波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、酶联检测仪。
隔离温室(10℃~30℃)。
酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研钵、微型
GB/T 33127—2016
磨杵等。
除有特别说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682
中相关规定。 DAS-ELISA 测
定试剂见附录B;PCR 检测试剂见附录C; 实时荧光PCR 检测试剂见附录D。
现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状，SSV 为害症状描述参见附录 A。
发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按 SN/T 2122
中规定进行抽样，并送
实验室检测鉴定。
7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)
对待检组织进行研磨，并按1:10(质量：体积)的比例加入抽提缓冲液，制备的汁液分别盛装于离
心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。具体操作步骤见附
录B。
植株叶片液氮研细，取0.1g 用于提取植物总DNA,
双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的
DNA 后进行常规 PCR 检测，具体操作步骤见附录 C。
实时荧光PCR
检测的阴性和阳性对照设置同7.1,双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的
DNA 后进行实时荧光PCR 检测，具体操作见附录D。
按照 SN/T 1840
中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态。在免疫电镜下如观察到
大小为30 nm×20nm 的杆状双联体粒体，即可判定结果阳性。
样品检测时，检测结果判定按下述原则进行：
——样品经PCR 检测为阴性；或者样品经 PCR
检测为阳性，但是序列测定结果与目的序列不一
致，则判定样品不携带甘蔗线条病毒。
——样品经 PCR
检测为阳性，且序列测定结果为目的序列；同时免疫电镜、DAS-ELISA、
荧光PCR
这三种检测方法其中一种为阳性检测结果，即可判定样品携带甘蔗线条病毒。
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经检验确定携带甘蔗线条病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。实验样品保存在-20℃
冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。
记录包括样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。双抗付
夹心酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，PCR
检测应有电泳结果照片。
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(资料性附录)
甘蔗线条病毒背景资料
A.1 寄主范围
甘蔗(Saccharum officinarum)、蒺藜草(Cenchrus
echinatus)、两耳草(Paspalum conjugatum)、柔
毛狗尾草(Setaria barbata)、弯叶画眉草(Eragrostis curvula)。
A.2 分布
印度、巴基斯坦、尼日利亚、贝宁、多哥、塞内加尔、科特迪瓦、肯尼亚、马拉维、毛里求斯、莫桑比克、
南非、苏丹、乌干达等许多国家和地区。
A.3 病害症状
SSV
影响寄主植物的整个生长期，可以导致对该病毒敏感品种11%以上的损失。受感染植株叶片
有无数小的斑点或条纹，病斑透明状，细窄，与叶脉平行。侵染后期，条斑不规则分布，植株下部叶片症
状严重，植株生长受阻。病毒主要分布在叶肉细胞、茎尖分生细胞及韧皮细胞中。
A.4 传播途径
SSV
可通过种茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播。可以通过多种叶蝉(Cicadulina
spp.)以 持
久性方式传播，在昆虫介体体内不能增殖，不能经过机械、嫁接、种子、花粉和植株间相互接触进行传播。
A.5 粒体形态
病毒粒体为双联体结构，大小30 nm×20 nm。
A.6 基因组
基因组为单链环状 DNA, 长2760 nt 左右，病毒正义链有两个阅读开放框(ORF),
分别编码运动
蛋白和外壳蛋白；互补链编码2个 ORF, 经 mRNA 剪接合成复制酶蛋白。
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(规范性附录)
双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA )
B.1 主要试剂
B.1.1 包被抗体
特异性的甘蔗线条病毒抗体。
B.1.2 酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的甘蔗线条病毒抗体。
B.1.3 样品抽提缓冲液(pH 7.4)
亚硫酸钠(Na₂SO₃) 1.3 g
聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW 24000～40000) 20 g
叠氮钠(NaN₃) 0.2 g
吐温-20 20 mL
溶于900 mL 的 1 ×PBST 中，用 HCl 调节 pH 至7.4,定容至1000 mL。
B.1.4 10×PBST 缓冲液(pH 7.4)
氯化钠(NaCl)
磷酸二氢钾(KH₂PO₄)
磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)
氯化钾(KCl)
吐温-20
溶于900 mL 的蒸馏水中，用浓盐酸(HCI)
调节 pH 至7.4,并定容至1000 mL。
B.1.5 包被抗体缓冲液(pH 9.6)
碳酸钠(Na₂CO₃) 1.59 g
碳酸氢钠(NaHCO₃) 2.93 g
溶于900 mL 蒸馏水中，用浓盐酸(HCI) 调节 pH 至9.6,并定容至1000 mL。
B.1.6 酶标抗体缓冲液(pH7.4)
1×PBST 缓冲液
牛血清白蛋白(BSA)
PVP(MW 24000～40000)
用无菌蒸馏水定容至1000 mL。
B.1.7 底物(pNPP) 缓冲液(pH 9.8)
二乙醇胺(C₄H₁NO₂)
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叠氮钠(NaN₃) 0.2 g
溶于600 mL 的无菌蒸馏水中，用浓盐酸(HCl) 调节 pH
至9.8,然后用蒸馏水定容至1000 mL。
B.1.8 反应终止液
氢氧化钠(NaOH)120g 溶于1000 mL 的无菌蒸馏水中，浓度3 mol/L。
B.2 实验步骤
B.2.1 包被抗体
用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释，加入酶联板孔中，100μL/
孔，加盖，37℃孵育2 h,清空孔中
溶液，PBST 洗涤4次，每次3 min。
B.2.2 样品制备
待测样品幼嫩叶片按1:10(质量：体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000
g 离心10 min,
上清液即为制备好的检测样品。对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。
B.2.3 加样
加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100μL/ 孔，加盖，37℃孵育2 h
或4℃冰箱孵育过
夜 ，PBST 洗涤4次，每次3 min。
B.2.4 加酶标抗体
根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中，100μL/
孔，加
盖，37℃孵育2 h,PBST 洗涤4次，每次3 min。
B.2.5 加底物
将底物pNPP 加入底物缓冲液中，终浓度为1 mg/mL (现配现用),每孔加入100μL,
室温避光孵育
30 min。 必要时每孔加入50μL3 mol/L 氢氧化钠溶液终止反应。
B.2.6 读数
30 min 后用酶标仪在405 nm 处读 OD 值。
B.3 结果判定
B.3.1 对照孔的ODos
值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内，即：
缓冲液孔和阴性对照孔的 ODos 值均\<0. 15,当阴性对照孔的 ODos
值\<0.05时，按0.05计算；阳性
对照 OD 值/阴性对照 OD
值>5～10;同一样品的重复性基本一致。否则不能进行结果判断。
B.3.2 在满足了B.3.1 质量要求后，结果可判断如下：
样品 OD 值/阴性对照 OD 值>2,判为阳性；样品 ODs
可疑样品，需重新进行试验，或用其他方法加以验证；样品 OD
注：或者按照商品化DAS-ELISA 试剂盒操作程序进行操作。
值/阴性对照 OD
值/阴性对照 OD
值在阈值附近，判为
值\<2,判为阴性。
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C.1 主要试剂
C.1.1 提取缓冲液
2% CTAB,20 mmol/L EDTA,100
基乙醇。
(规范性附录)
常规 PCR 检测
mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1.4 mol/L NaCl,用前加0 .2%巯
C.1.2 电泳缓冲液 TAE(50×)
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸
乙二胺四乙酸二钠(EDTA 0.5 mol/L)
用时加蒸馏水稀释至1×TAE。
242
52.1
100
g
mL
mL
C.1.3 溴化乙锭(EB) 溶液(10μg/μL)
溴化乙锭
灭菌去离子水
C.2 实验步骤
C.2.1 植物总 DNA 提取
取植株材料约0.1 g,置于研钵中加液氮研磨成粉状，迅速加入600μL 的 2 % CTAB
抽提缓冲液 (65℃水浴预热),稍作研磨混匀；研磨液转入1.5 mL
离心管中，65℃水浴30 min～45 min,期间不时
摇匀，使其充分混匀；取出后，加入300μLTris 饱和酚与300 μL
三氯甲烷/异戊醇(24:1),混匀，剧烈 振荡30 s;室温下，12000 g 离心10 min;
取上清液置于新的离心管中，加入1/10体积3mol/L NaAc (pH5.2)
和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于一20℃冰箱20 min 以上；4℃,12000g
离心10 min, 弃上清液；用70%乙醇和无水乙醇分别洗 DNA
沉淀一次，室温下风干；沉淀溶于200 μL TE 中(含
RNase A 10 μg/mL,pH 8.0),37℃孵 育 1 h,-20 ℃保存备用。
注：或者按照商品DNA 提取试剂盒进行操作。
C.2.2 PCR 反应
C.2.2.1 PCR 引物
SSV-F:5'-TCTCAAGCCAGGTATTTATTGC-3',SSV-R:5'-ATGAAGACGGAGGGTATCACAT-3'。
目的扩增产物长度为465 bp。
C.2.2.2 PCR 反应体系
PCR 反应体系见表 C.1。
每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不
同的反应总体积进行适当调整。检测时以含甘蔗线条病毒的DNA
或含有甘蔗线条病毒目标片段的质
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粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。
PCR 反应条件：94℃ 5 min;94℃ 35s,54℃35s,72℃35s,30个循环；72℃10 min
延伸。
表 C.1 PCR 反应体系
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|---|---|---|
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10 μmol/L |
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10 μmol/L |
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10 μmol/L |
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5 U/μL |
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C.3 琼脂糖凝胶电泳检测
C.3.1 制备凝胶
用1×TAE 配制1.2%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。
C.3.2 加溴化乙锭
将 5 μL 溴化乙锭(EB) 加入到配制好的100 mL
凝胶中。将凝胶倒入凝胶槽中，插上样品梳子。冷
却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1×TAE, 缓冲液要没过凝胶表面约1 mm。
C.3.3 加样
将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔，同时设计 PCR
的阴性对照和阳性对照，并加入分子量标
准物(Marker)。
C.3.4 电 泳
接通电源，以3 V/cm～5V/cm 电场强度进行电泳，0.5 h 后观察结果。
C.3.5 结果观察
电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。
C.4 结果判定
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品未出现预期大小的条
带，则可判定样品为甘蔗线条病毒阴性。
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品出现预期大小条带，可
通过测序的方式进一步确认。如果PCR
产物序列与甘蔗线条病毒的序列一致，则可判定样品为甘蔗线
条病毒阳性，若序列不一致，则可判定样品为甘蔗线条病毒阴性。
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(规范性附录)
实时荧光 PCR 检测
D.1 试 剂
核酸提取试剂同 C.1。
TaqMan PCR Mixture。
D.2 引物探针
引物序列：SSV-Fq:5'-CCTCTCTCCCAGTATGTA-3',SSV-Rq:5'-TGTCCATTAGAACCT-
GAA-3'。
探针序列：SSV-P:5'-FAM-CGTATGCTCTGACCTTGTTGGC-TAMRA-3'。
D.3 核酸提取
方法同 C.2.1。
D.4 实时荧光 PCR 反 应
实时荧光PCR 反应体系见表D.1, 每个样品及对照设2个平行处理。检测时以含
SSV 的材料作为
阳性对照；以健康植物材料作为阴性对照；以水代替DNA 模板作为空白对照。
表 D.1 实时荧光 PCR 反应体系
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|---|---|---|
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10 μmol/L 10 μmol/L 10 μmol/L 5 U/μL |
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反应条件：95℃10 min;95℃ 5s,60 ℃30 s,40个循环。
点击运行，进行 PCR
反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出△Rn (荧光信号
增加值)与循环数之间关系的图像。
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D.5 结果判定
在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线、阳性对照 Ct
值≤30并出现典型扩增曲线的条 件下：
待测样品的 Ct 值≥40时，判定 SSV 阴性。
— 待测样品的Ct 值≤35时，判定 SSV 阳性。
———待测样品的35\<Ct 值 \< 4 0 时
，应重新进行测试；如果重新测试的 Ct 值≥40时，判定 SSV 阴
性；如果重新测试的Ct 值\<40,则判定 SSV 阳性。
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